Bt基因抗虫棉抗虫性室内鉴定及评价方法

马丽华, 宋晓轩

(中国农科院棉花研究所,  河南 安阳 455112)

    通过生物技术把抗虫基因导入棉花,培育抗虫棉花新品种,是综合治理棉花害虫的一个重要手段。为了满足科研、生产等领域对转Bt基因抗虫棉花抗虫性鉴定的需要,及时提供准确可靠的鉴定结果,我们自1997年以来,对转Bt基因抗虫棉花的抗虫性及其鉴定方法进行了研究,提出了转Bt基因抗虫棉抗虫性室内鉴定及评价方法。

1  室内生物测定方法采用马丽华提出的棉花抗棉铃虫性室内生物测定新方法,该方法经长期使用,证明具有结果稳定,重复性强,数据准确可靠等特点。

2  转Bt基因棉抗虫性室内鉴定评价方法

2.1 转Bt基因棉抗虫性

2.1.1  棉花不同生长时期对棉铃虫的抗性。

利用棉花抗棉铃虫性室内生物测定方法对转Bt基因棉花品种(材料)在不同生长时期对棉铃虫的抗性进行了研究(表1)。由表1、表2结果可以看出,转基因棉花品种(材料)在不同生长时期对棉铃虫的抗性不同,棉铃虫幼虫死亡率在棉花不同生长时期有很大差异。即在棉花生长前期(蕾期), 幼虫死亡率很高达97.36%~99.48%,但到后期(铃期),幼虫死亡率降低至43.62%~66.22%。在科学研究和生产实际中,经常需要随时对转Bt基因棉花进行抗性鉴定和筛选,根据以上结果,如果单纯用棉铃虫幼虫死亡率或存活率进行转Bt基因棉的抗性评价,则很难建立一个统一的评判标准。

表1  棉花不同生长时期棉铃虫幼虫死亡率   (1997年)

材料名称

幼虫校正死亡率/%

06-20

07-04

07-18

08-01

08-15

110-12

100.00

100.00

97.68

97.15

100.00

97027

91.66

68.29

86.92

83.93

78.13

RH-1

100.00

86.83

86.05

82.86

77.05

265-268

97.50

71.46

93.72

92.29

67.50

97013

100.00

53.66

56.05

46.00

27.78

97012

95.00

89.02

76.45

71.07

46.88

平均

97.36

78.21

82.81

78.88

66.22

表2  棉花不同生长时期棉铃虫幼虫死亡率   (2000年)

材料名称

幼虫校正死亡率/%

蕾期

盛花期

花铃期

铃期

GK12

100

29.12

81.25

57.45

(GK12×5121)F1

97.92

29.12

53.32

36.17

SGK9708

100

58.33

60.42

46.81

(SGK9708×5121)F1

100

37.5

41.67

34.04

平均

99.48

38.52

59.17

43.62

中棉所19(CK)

0

0

2.08

0

注:表2转基因抗虫材料由本所郭香墨研究员提供。

2.1.2       转Bt基因棉对棉铃虫幼虫生长发育的影响。

1999年利用棉花抗棉铃虫性室内生物测定方法研究了9708(中棉所41)、中棉所30、苏抗103和HG-BR-8等棉花品种对棉铃虫生长发育的影响。每个材料挂牌定株25株,并用卡那霉素检测法[2]进行田间抗性棉株鉴定,有黄色反应者,为非转Bt基因棉株,反之,为转Bt基因棉株(表3)。

表3 棉花不同时期对棉铃虫幼虫生长发育的影响(1999年)

材料名称

幼虫存活率/%

3龄以上幼虫株数

卡那霉素

反应株数

蕾期

花铃期

蕾期

花铃期

9708

0

40

0

0

0

中棉所30

0

54

0

0

0

RT4-4

29

68

6

6

6

新棉33B

0

64

0

0

0

苏抗103

38

78

5

5

5

中棉所19(CK)

96

85

25

25

25

HG-BR-8(CK)

92

83

25

25

25

    由表3可知,在各参试材料的不同生长时期,虽然棉铃虫幼虫存活率不同,但3龄以上幼虫株数高度一致,并与田间卡那霉素检测结果一致。即,非转Bt基因棉株上均有3龄以上棉铃虫幼虫,而转Bt基因棉株上则无3龄以上幼虫,说明棉铃虫幼虫在非转Bt基因棉株上能够正常生长发育,顺利完成其发育历期,反之,在转Bt基因棉株上,即使后期幼虫存活率较高,但棉铃虫幼虫生长明显受阻,发育迟缓。二者之间有明确的界限。

表4  三代棉铃虫发生期室内测定结果(2001年)%

材料名称

幼虫存活率

3龄以上幼虫率

蕾铃被害减退率

鲁9154

62

4

84.73

SGK321

44

4

77.53

GKZ1

42

4

79.70

中杂7号

62

6

88.29

97杂1

60

6

83.35

GKZ2

64

8

87.89

鲁1138

64

10

86.49

鲁S6154

50

10

84.86

冀南98

72

10

71.05

SGK9708-41

48

10

74.58

鲁7H1

70

12

84.73

GKZ3

52

12

82.23

邯154

54

18

71.02

中221

62

20

78.66

中BZ12

72

20

90.61

中抗杂5号

78

28

84.26

南抗3号

76

32

61.93

HG-BR-8

76

62

0.00

9409

92

86

11.05

注:供试抗虫材料来源于棉花抗虫区试,HG-BR-8为区试常规对照、高酚棉,9409(中棉所35)为常规棉。

由表4可以看出,三代棉铃虫发生期,棉铃虫幼虫在转Bt基因棉上的存活率均较高,与常规对照差异较小,而3龄以上幼虫率则与对照有明显的差异。如以棉铃虫3龄以上幼虫率小于10、大于等于10而小于30、大于等于30而小于50、大于50将其划分为4组,与田间罩笼鉴定[3]的蕾铃被害减退率进行相关分析,相关系数(r)=-0.7865,二者间达极显著负相关(r0.01=0.6652)。说明,棉铃虫3龄以上幼虫率高时,蕾铃被害减退率较低,蕾铃被害率较高,反之,棉铃虫3龄以上幼虫率低时,蕾铃被害减退率较高,蕾铃被害率较低。

综合表3、4结果可以看出,用3龄以上幼虫作为转Bt基因棉抗性评价指标,比幼虫存活率(或相对死亡率)更能客观地反映参试材料的特性。2.2 转Bt基因棉抗虫性室内评价方法通过对每年200余份样品的试验数据进行总结和分析,我们认为,对转Bt基因棉进行抗虫性评判,以幼虫校正死亡率和3龄以上幼虫率为指标,较为准确,并符合生产实际。

2.2.1  棉花生长前期(苗期)。

以参试材料的幼虫校正死亡率(M)及3龄以上幼虫率(L)为评判指标,计算公式为:M=(1-参试材料幼虫存活率/对照品种幼虫存活率)×100%   L=(3龄以上幼虫数/接虫总数)×100%

2.2.2  棉花生长后期(花铃期及以后)。

以参试材料的3龄以上幼虫率(L)为评判指标。计算公式同上。

2.3 转Bt基因抗虫棉室内生物测定抗性评价标准

表5  转Bt基因抗虫棉室内生物测定抗性评价标准

抗性级别

苗期至蕾期

花铃期及以后

幼虫校正死亡率/%

3龄以上幼虫率/%

3龄以上幼虫率/%

高抗(1级)

M≥95

0

L<10

抗(2级)

95>M≥80

L<10

30>L≥10

中(3级)

80>M≥50

30>L≥10

50>L≥30

感(4级)

M<50

L≥30

L≥50

3 讨论

    随着转Bt基因棉研究的不断深入,转Bt基因棉以其明显的抗虫优势在生产上占据愈来愈重要的地位。转Bt基因棉的检测方法主要有分子生物学检测法[3]、标记基因检测法[4]和生物学鉴定法[5]。但对转Bt基因棉花品种的抗性评价仍有赖于生物学鉴定法。目前,对转Bt基因棉花新品种(系)的室内抗性评价多以幼虫死亡率为指标,由于转Bt基因棉的抗虫性因棉花不同生长发育期呈动态变化,棉花生长后期,棉铃虫幼虫存活率明显增高,死亡率下降,单纯以幼虫死亡率为指标很难满足参试材料各个时期抗虫性鉴定的需要。棉花区试材料和新品种(系)的抗虫鉴定利用田间罩笼鉴定法[6],该方法主要在二代棉铃虫发生期,以棉花蕾铃被害减退率为指标进行抗性评判,可以人工控制选择压力,鉴定条件接近自然,能够准确反映参试材料的抗性。但后期的鉴定因棉花植株增大、蕾铃自然脱落增加等客观条件限制,再进行罩笼鉴定就变得非常困难,甚至不可能。本文提出的转Bt基因棉抗虫性室内鉴定方法,和以幼虫校正死亡率和3龄以上幼虫率为指标,评判转Bt基因棉对棉铃虫的抗性,比以往单纯以幼虫死亡率为指标更能客观地反映参试材料的特性。经国家、省级抗虫棉区域试验及所内外各类试验反复验证,证明其具有较高的准确性;同时,由于操作简便,试验周期短,可随时满足科研和生产的需求。

(来源:《中国棉花 》2003.01)